Estudio de la interacción de los promastigotes y vesículas de membrana secretadas de leishmania spp. con el plasminógeno, componente del sistema fibrinolítico
Fecha
2013-07-17Autor
Figuera Figuera, Lourdes Josefina
Metadatos
Mostrar el registro completo del ítemResumen
La interacción de una gran variedad de organismos patógenos, tanto procariotas como
eucariotas con los componentes del sistema fibrinolítico, podría ser considerado un
posible evento universal implicado en el proceso de invasión, diseminación y
establecimiento de los patógenos en el hospedador. Esta interacción puede ser
mediada a través de receptores localizados en la superficie celular, vesículas
secretadas y/o proteínas con capacidad de unión al plasminógeno que le permitan al
patógeno secuestrar componentes del sistema fibrinolítico del hospedador,
promoviendo así la degradación de la fibrina y proteínas de la matriz extracelular.
Asimismo, entre los organismos eucariotas, se ha demostrado que Leishmania
mexicana, agente causal de la Leishmaniasis cutánea, tiene la capacidad de
interaccionar con los componentes del sistema fibrinolítico: plasminógeno y
plasmina. En ese sentido, se realizó un estudio de la interacción de los promastigotes
y vesículas de membrana secretadas por Leishmania spp. con el plasminógeno. Las
vesículas de membrana de Leishmania spp. fueron purificadas por ultracentrifugación
luego de someter los parásitos a un proceso de secreción en medio mínimo durante 24
horas. La caracterización bioquímica de las vesículas de membrana de L. mexicana se
llevó a cabo mediante electroforesis, Western blotting y Ligand blotting utilizando
plasminógeno como ligando. Se detectaron diferentes proteínas: factor de elongación la,
fosfoglicerato quinasa, gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa, GP63, y dos
proteínas receptoras de plasminógeno: Enolasa y LACK. Adicionalmente se logró
identificar por espectrometría de masas un nuevo receptor de plasminógeno, el cual
fue posteriormente clonado y sobreexpresado en Escherichia coli. Este receptor es la proteína miristoilada pequeña 1 (SMP-l). SMP-l recombinante fue capaz de unir
plasminógeno de manera dosis dependiente y saturable, con una constante de
disociación (Kd) de 0,24 uM, valor que se encuentra dentro del rango fisiológico de la
concentración de plasminógeno sanguíneo. Esa interacción fue inhibida por el ácido
F-aminocaproico, sugiriendo que en la unión están involucrados residuos de lisina;
asimismo, los ensayos realizados con carboxipeptidasa B, confirmaron una inhibición
en un 65% de la interacción, indicando que la lisina encontrada en el extremo
carboxiloterminal está implicada en el reconocimiento con el plasminógeno.
Empleando los anticuerpos polic1onales anti SMP-l, se demostró la presencia de
SMP-l en el flagelo y en las vesículas de membrana de las tres especies de
Leishmania. Se demostró a su vez que L. braziliensis y L. infantum, al igual que L.
mexicana, también tienen la capacidad de unir plasminógeno humano, siendo mayor
en los promastigotes en fase estacionaria y los sometidos a choque térmico,
observándose gran analogía en la inhibición de la interacción parásitos-plasminógeno
por el ácido e:-aminocaproico, sugiriendo que en la unión están involucrados residuos
de lisina. Los valores de constantes de disociación (Kd) para la unión con
plasminógeno son similares, denotando que no existen diferencias considerables en la
capacidad de unión al plasminógeno entre las tres especies de Leishmania evaluadas.
Estos hallazgos nos permiten proponer como modelo que los promastigotes de
Leishmania spp. en fase estacionaria expresan receptores de plasminógeno en su
superficie y además secretan vesículas de membrana que contienen estos mismos
receptores: Enolasa, LACK y SMP-I, que podrían constituir nuevos factores de
virulencia en Leishmania. The interaction of a wide variety of pathogenic organisms, both prokaryotic and
eukaryotic with fibrinolytic system components, could be considered a possible
universal event involved in the invasion process, dissemination and establishment of
pathogens in the hos1. This interaction may be mediated through receptors located on
cellular surface, secreted vesicles and/or proteins with plasminogen binding capacity
that would allow the components sequester pathogens host fibrinolytic system, this
promoting the degradation of fibrin net and extracellular matrix proteins. Also among
eukaryotic organisms, it have been shown that Leishmania mexicana, causal agent of
cutaneous Leishmaniasis, has the ability to interact with the fibrinolytic system
components: plasminogen and plasmin. In this sense, a study of the interaction of
promastigotes and secreted membrane vesicles of Leishmania spp. with the
plasminogen was carried out. Membrane vesicles of Leishmania spp.were purified by
ultracentrifugation after submitting the parasites to a process of secretion in a
minimum medium for 24 hours. The biochemical characterization of the membrane
vesicles of L. mexicana was carried out by electrophoresis, Western blotting and
Ligand blotting using plasminogen as a ligando Different proteins were detected:
elongation factor-la, phosphoglycerate kinase, glyceraldehydes 3 phosphate
deshydrogenase, GP63, and two receptors proteins plasminogen: Enolase and LACK.
Additionally, we identified by mass spectrometry a new plasminogen receptor, which
was subsequently cloned and overexpressed in Escherichia coli. This receptor is a
small myristoylated protein SMP-I. SMP-l recombinant was able to bind
plasminogen in adose dependent and saturable manner with a dissociation constant
(Kd) of 0,24 uM, value that is within the physiological range of the plasminogen
blood concentration. This interaction was inhibited by e-aminocaproic acid,
suggesting that in the binding are implicated lysine residues. Further, assays performed with carboxypeptidase B treatment, confinned an inbibition of 65%,
indicating that lysine residue found at the carboxyItenninal end is involved in the
recognition of plasminogen. Using polyclonal antibodies anti SMP-l, it was showed
the presence of SMP-l in the flagelhun and in the membrane vesicles of the three
Leishmania species. Also we demonstrated that L. braziliensis and L. injemtum, like
L. mexicana, have the ability to bind human plasminogen, this binding being higher
in stationary phase promastigotes and those submitted to heat shock. In all case the
binding was inhibited by r-aminocaproic acid, suggesting that lysine residues are
involved. Values of dissociation constant (Kd) for the binding to plasminogen are
similar, denoting dIere are not considerable differences in plasminogen binding
capacity between the three Leishmania species tested. These findings allow us to
propose as model that promastigotes of Leishmania spp. in the stationary phase,
express plasminogen receptors on their surface and also secreted membrane vesicles
contailling the same receptors: Enolase, LACK al1d SMP-l, which could be new
virulence factors in Leishmania.