Análisis in silico, docking molecular, expresión, purificación y evaluación de la actividad de la enzima Per-ARNT-Sim fosfogliceratoquinasa (PAS-PGK) recombinante de Trypanosoma cruzi

Abstract

Los dominios Per-ARNT-Sim (PAS) son estructuras protéicas conservadas que cumplen funciones diversas, en donde se resalta la habilidad de actuar como sensores biológicos y estar involucrados en procesos de señalización. Recientemente en Trypanosoma cruzi se ha identificado y caracterizado una isoenzima fosfoglicerato quinasa (PGK) asociada a un dominio PAS denominada PAS-PGK cuyo rol preciso en el parásito aún no ha sido dilucidado, y se ha sugerido que el dominio PAS podría ayudar en las adaptaciones metabólicas que sufre durante su ciclo de vida. En este trabajo se hicieron estudios in silico para predecir la estructura tridimensional de la proteína y se evaluó su unión a ligandos mediante acoplamiento molecular utilizando las herramientas bioinformáticas Phyre2, QUARK, RAMPAGE y SwissDock. Adicionalmente, se optimizó la sobreexpresión y purificación de la proteína PAS-PGK recombinante de T. cruzi, para luego evaluar su actividad catalítica bajo distintas condiciones. Para esto se utilizó la cepa BL21 DE3 y Rosetta de Escherichia coli, en medio TB a 25 ºC, y se probaron varias condiciones de purificación utilizando una columna de afinidad a metales His-Link. Los estudios bioinformáticos indican que la proteína es una PGK clásica unida a un dominio PAS ubicado en la región N-terminal y presenta una interacción favorable a través de este dominio con la glucosa y el FAD+. Los ensayos experimentales muestran que la proteína PAS-PGK recombinante T. cruzi se expresa mayoritariamente en la fracción insoluble en forma de cuerpos de inclusión, el pequeño porcentaje de proteína soluble se logró purificar a homogeneidad saliendo en las fracciones eluidas con concentraciones de 125-150 mM de imidazol. Además, se encontró que la proteína PAS-PGK recombinante de T. cruzi no es activa bajo las condiciones evaluadas, por lo que se sugiere realizar estudios con la proteína nativa para hacer la caracterización cinética de la enzima.