Selección de microorganismos productores de enzimas quitinolíticas y caracterización de la actividad extracelular de dos aislados de Serratia sp.

Abstract

Las quitinasas son enzimas que hidrolizan la quitina en sus componentes oligo y monoméricos. Los quito-oligosacáridos, la glucosamina y los monómeros de N-acetil-D-glucosamina son de gran interés para la industria debido a su amplio rango de funciones biológicas: biomédicas, agrícolas, farmacéuticas y bioconservadoras de alimentos. En el presente trabajo, se realizó la caracterización quitinolitica extracelular de las cepas BIOMI-363706 y SM-BIOMI, descritas molecularmente como Serratia sp. Estos dos aislados bacterianos usan la quitina coloidal (QC) como única fuente de carbono y nitrógeno. Fueron inoculados en un medio que contenia 2% y 5% de QC, 0,1% K2HPO4 у 0,05% MgSO47H2O, con pH 7,2; y después de 72 horas de incubación a 37 °C produjeron óptimamente quitinasa extracelular. Usando los extractos crudos, se determinó que las quitinasas de BIOMI-363706 y SM-BIOMI tenían un pH óptimo de 6 y 6,5, respectivamente, una temperatura óptima de 50 °C; y el rango de estabilidad se situó entre 10 °C y 50 °C. No se observó un efecto notorio sobre la actividad quitinasa de ambas enzimas en presencia de cationes divalentes. En cambio, se evidenció que estas enzimas lograron ser activadas utilizando diferentes sustratos, con el siguiente orden de actividad: quitina coloidal polvo de quitina (<1mm) > glicol-quitina. Por otra parte, tanto BIOMI-- 363706 como SM-BIOMI presentaron un valor de Vmáx de 0,015 µmol min-1 y 0,045 µmol min-1; y un Km de 1,278 mg.ml-1 y 1,231 mg.ml-1, respectivamente. A continuación, se seleccionó a BIOMI-363706 como cepa de trabajo por producir los mayores niveles de quitinasa en el biorreactor. Así, el crecimiento celular de la cepa, con el empleo de QC al 2 % como sustrato, mostró una fase de crecimiento exponencial de hasta 16 h. Además, la producción de quitinasa fue proporcional al crecimiento celular, ya que expresó valores máximos de actividad quitinolitica de 2,043 U ml después de 24 h a pH 7,7. Finalmente, se evaluó el acoplamiento de las enzimas de Serratia sp. BIOMI-363706 y la desacetilasa de quitina (CDA) de Mucor sp. BIOMI-CIEPE-01 para incrementar la desacetilación de la quitina coloidal. Se utilizaron 8,5 mU de CDA enriquecidas con 76 mU de quitinasa, y se incubaron a 45 °C, con pH 7,0. La velocidad de la CDA sobre la quitina coloidal aumentó 3,9 ± 0,8 veces, con lo cual se obtuvieron 6,5 ± 0,6 veces más de µmoles de acetato liberadas después de 8 h de reacción. Por lo tanto, en el contexto de los estudios de la desacetilación enzimática, la enzima BIOMI-363706 puede resultar una opción valiosa y ser una ventaja para la maximización de reacciones en escalas industriales que mejoren y potencien la degradación enzimática de la quitina.

Chitinases are hydrolytic enzymes that break down glycosidic bonds in monomeric and oligomeric components. The chito-oligosaccharides, glucosamine and N-acetyl-Dglucosamine monomers are of great interest for industry due to its wide range of biological applications in several areas: biomedicine, agriculture, pharmaceutics and food biopreservations. In this academic work was made the extracellular chitinolytic characterization of the strains BIOMI-363706 and SM-BIOMI described at the molecular level as Serratia sp. These two bacterial isolates use colloidal chitin (QC) as unique carbon and nitrogen source. They were inoculated in a medium containing 2% and 5% QC; 0.1% K2HP04 ; 0.05% MgS04.7H20, pH 7.2. After 72 hours incubation at 37° C, they produced optimally extracellular chitinase. Using the crude extracts it was determined that chitinases BIOMI-363706 and SM-BIOMl had an optimum pH 6 and 6.5, respectively; an optimum temperature of 50 o C; and the stability range was 10 o C-50 o C. Presence of divalent cations did not produce considerable effect on chitinase activity of both enzymes. Instead, it was evident that these enzymes could be activated using different substrates, with the following order of activity: colloidal chitin> chitin powder (<1 mm)> glycol-chitin. Moreover, both BIOMI-363706 and SM-BIOMI had a Vmax = 0.015 mol.min- 1 and 0.045 mol.min-l, Km =1.278 and 1.231 mg.ml-1, respectively. Hence BIOMI-363706 was chosen as work-strain for producing higher levels of chitinase in the bioreactor. Thereby the cellular growth of this strain, using 2% QC as substrate, showed an exponential growth phase up to 16 h. Moreover, the production of chitinase was proportional to cell growth, being that it expressed a maximum chitinolytic activity = 2.043 U ml-1 after 24 h at pH 7.7. Finally, it was evaluated the coupling of the enzymes BIOMI-363706 from Serratia sp and chitin deacetylase (CDA) from Mucor sp. BIOMI-CIEPE-01 to increase the deacetyIation of colloidal chitin. It was used 8.5 mU of CDA enriched with 76 mU of chitinase, and they were incubated at 45° C, pH 7.0. The CDA velocity, on colloidal chitin, increased 3.9 ± 0.8 times, whereby it was obtained 6.5 ± 0.6 times more moles acetate released after 8 hours of reaction. Therefore, in the context of studies on the enzymatic deacetylation, the enzyme BIOMI-363 706 could be a valuable option and be advantageous for maximizing reactions in industrial scales that improve and enhance the enzymatic degradation of chitin.