Estudio mecanístico in vitro de la reacción de glucación no enzimática de la hemoglobina con edulcorantes
Resumen
La glucación no enzimática es una reacción que sufren las proteínas por medio de la
unión covalente entre azúcares reductores simples y grupos amino libres de las proteínas,
para formar estructuras cíclicas complejas sin la participación de la enzima. Esta reacción se
encuentra relacionada con el desarrollo de las complicaciones secundarias de la diabetes
mellitus, enfermedad de Alzheimer y el normal envejecimiento. El paso inicial de la reacción
de glucación no enzimática de la hemoglobina es la formación de la base Schiff,
produciéndose un reordenamiento de Amadori, para dar finalmente una cetoamida
(hemoglobina glucada HbAlc). La glucosa es el azúcar reductor más abundante en el
organismo. Esto implica que sea este azúcar el considerado generalmente en las reacciones
de glucación no enzimática de interés biológico. Sin embrago, cualquier azúcar que posea un
grupo carbonilo libre puede reaccionar con los grupos aminos primarios de las proteínas para
formar la base Schiff. La reactividad de los distintos azúcares está dada por la disponibilidad
de su grupo carbonilo. Las moléculas de azúcar consiguen estabilizarse a través de un
equilibrio entre la forma abierta y por lo menos dos formas cerradas (anómeros cíclicos) en
las que el grupo carbonilo ha desaparecido. En el estudio de la hidrólisis ácida para el
edulcorante con sucralosa comercial y sucralosa pura realizado al variar la concentración de
ácido clorhídrico entre 2-8 N a 37°C, no se encontró ninguna variación en las rotaciones
óptica observadas, lo cual confirma que dichos edulcorantes no presenta hidrólisis bajo estas
condiciones de reacción. Se prepararon mezclas de reacción con varios azúcares o
edulcorante utilizando las siguientes concentraciones; para sacarosa, sucralosa y fructosa de
40 mM y la hemoglobina a 9,3xl0-2 mM. Las concentraciones del buffer fosfato fueron
variadas entre 1-8 mM permaneciendo esta mezcla de reacción por tres días para la fructosa
y por 28 días para los demás azúcares a 37°C y pH 7,30. La hemoglobina glucada (HbAlc)
formada, fue separada por cromatografia de intercambio iónico (Teco Diagnostic) y
cuantificada espectroscópicamente a 415 nm. Se encontró que la fructosa es catalizada por el
buffer fosfato. La constante catalítica (kB) para la fructosa es siete veces más rápida que la
de glucosa y la reacción espontánea (ko) para la fructosa es nueve veces más grande que la
de glucosa bajo las mismas condiciones de reacción para los demás azúcares las constantes
de velocidad no superaron la reportada para la glucosa, resultado que sugiere una reacción de hidrólisis muy lenta. Además no se encontró efecto isotópico de solvente para ninguno de
los azúcares en estudio. La reacción con el liofilizado de Stevia rebaudiana a concentraciones
entre (5, 10, 20) mg/mL, la glucosa a 40 mM, el buffer fosfato 4,8 mM y la hemoglobina
9,3xI0-2 mM, bajo las misma condiciones de reacción que el caso anterior, presentó un efecto
inhibitorio sobre la glucación no enzimática de la hemoglobina in vitro y, además podría ser
de valor terapéutico en el tratamiento de la diabetes, ya que las constantes de velocidad para
la reacción disminuyen en presencia de la especie vegetal, y con el aumento de la
concentración de la misma. Observando también que los valores obtenidos para la
concentración de la glucosa total disminuyen al aumentar la concentración de la Stevia
rebaudiana, lo que es indicativo de la actividad hipoglicemiante que presenta la planta. Nonenzymatic glycation is a reaction experienced by proteins by simple covalent
linkage between reducing sugars and free amino groups of proteins to form complex ring
structures without involving the enzyme. This reaction are related to the development of
secondary complications of diabetes mellitus, Alzheimer's disease and normal aging. The
initial step of the reaction of nonenzymatic glycation of hemoglobin is the Schiff base
formation, producing an Amadori rearrangement, to finally give a ketoamide (glycated
hemoglobin HbA1C). Glucose is the most abundant in the body reducing sugar. This implies
that this sugar is generally considered in the non-enzymatic glycation reactions of biological
interest. No clutch, any sugar possessing a free carbonyl group can react with the primary
amino groups of proteins to form a Schiffbase. The reactivity of the different sugars is given
by the availability of its carbonyl group. Sugar molecules get stabilized by a balance between
the open form and at least two closed forms (cyclic anomers) in which the carbonyl group
has disappeared. In the study of the acid hydrolysis to the commercial sweetener sucralose
and sucralose pure performed by varying the concentration of hydrochloric acid at 2-8 N at
37 C°, no variation was found in the observed optical, which confirms that these sweeteners
no hydrolysis under these reaction conditions. Reaction mixtures were prepared with various
sugars or sweetener using the fol1owing concentrations; 40 mM for sucrose, sucralose and
fructose and 9,3xlO-2 mM hemoglobin were prepared. Phosphate buffer concentrations were
varied between 1-8 mM remaining this reaction mixture for three days for fructose and 28
days for all other sugars at 37 °C and pH 7,30. The glycated hemoglobin (HbA1C) formed
was separated by ion exchange chromatography (Teco Diagnostic) and quantified
spectrophotometrical1y at 415 nm. It was found that fructose is catalyzed by the phosphate
buffer. The catalytic constant (kB) for fructose is seven times faster than glucose and
spontaneous reaction (ko) for fructose is nine times larger than that of glucose under same
reaction conditions other sugars rate constants did not exceed that reported for glucose, result
suggesting of slow hydrolysis reaction. Also not isotopic solvent effect for any of the sugars
found in study. Reaction with Stevia rebaudiana lyophilized at concentrations between (5,
10, 20) mg/mL, 40 mM glucose, 4.8 mM phosphate buffer and 9,3x10-2 mM hemoglobin
under the same conditions reaction above, showed an inhibitory effect on the non-enzymatic
glycation of the hemoglobin in vitro and in addition may be of therapeutic value in the
treatment of diabetes, because the rate constants for the reaction decreases in the presence of
the species plant, and with the increase in concentration thereof. Noting also that the values
obtained for the total glucose concentration decrease with increasing concentration of Stevia
rebaudiana, which is indicative of the hypoglycemic activity with the plant.