Estudio mecanístico in vitro de la reacción de glucación no enzimática de la hemoglobina con edulcorantes

Abstract

La glucación no enzimática es una reacción que sufren las proteínas por medio de la unión covalente entre azúcares reductores simples y grupos amino libres de las proteínas, para formar estructuras cíclicas complejas sin la participación de la enzima. Esta reacción se encuentra relacionada con el desarrollo de las complicaciones secundarias de la diabetes mellitus, enfermedad de Alzheimer y el normal envejecimiento. El paso inicial de la reacción de glucación no enzimática de la hemoglobina es la formación de la base Schiff, produciéndose un reordenamiento de Amadori, para dar finalmente una cetoamida (hemoglobina glucada HbAlc). La glucosa es el azúcar reductor más abundante en el organismo. Esto implica que sea este azúcar el considerado generalmente en las reacciones de glucación no enzimática de interés biológico. Sin embrago, cualquier azúcar que posea un grupo carbonilo libre puede reaccionar con los grupos aminos primarios de las proteínas para formar la base Schiff. La reactividad de los distintos azúcares está dada por la disponibilidad de su grupo carbonilo. Las moléculas de azúcar consiguen estabilizarse a través de un equilibrio entre la forma abierta y por lo menos dos formas cerradas (anómeros cíclicos) en las que el grupo carbonilo ha desaparecido. En el estudio de la hidrólisis ácida para el edulcorante con sucralosa comercial y sucralosa pura realizado al variar la concentración de ácido clorhídrico entre 2-8 N a 37°C, no se encontró ninguna variación en las rotaciones óptica observadas, lo cual confirma que dichos edulcorantes no presenta hidrólisis bajo estas condiciones de reacción. Se prepararon mezclas de reacción con varios azúcares o edulcorante utilizando las siguientes concentraciones; para sacarosa, sucralosa y fructosa de 40 mM y la hemoglobina a 9,3xl0-2 mM. Las concentraciones del buffer fosfato fueron variadas entre 1-8 mM permaneciendo esta mezcla de reacción por tres días para la fructosa y por 28 días para los demás azúcares a 37°C y pH 7,30. La hemoglobina glucada (HbAlc) formada, fue separada por cromatografia de intercambio iónico (Teco Diagnostic) y cuantificada espectroscópicamente a 415 nm. Se encontró que la fructosa es catalizada por el buffer fosfato. La constante catalítica (kB) para la fructosa es siete veces más rápida que la de glucosa y la reacción espontánea (ko) para la fructosa es nueve veces más grande que la de glucosa bajo las mismas condiciones de reacción para los demás azúcares las constantes de velocidad no superaron la reportada para la glucosa, resultado que sugiere una reacción de hidrólisis muy lenta. Además no se encontró efecto isotópico de solvente para ninguno de los azúcares en estudio. La reacción con el liofilizado de Stevia rebaudiana a concentraciones entre (5, 10, 20) mg/mL, la glucosa a 40 mM, el buffer fosfato 4,8 mM y la hemoglobina 9,3xI0-2 mM, bajo las misma condiciones de reacción que el caso anterior, presentó un efecto inhibitorio sobre la glucación no enzimática de la hemoglobina in vitro y, además podría ser de valor terapéutico en el tratamiento de la diabetes, ya que las constantes de velocidad para la reacción disminuyen en presencia de la especie vegetal, y con el aumento de la concentración de la misma. Observando también que los valores obtenidos para la concentración de la glucosa total disminuyen al aumentar la concentración de la Stevia rebaudiana, lo que es indicativo de la actividad hipoglicemiante que presenta la planta.

Nonenzymatic glycation is a reaction experienced by proteins by simple covalent linkage between reducing sugars and free amino groups of proteins to form complex ring structures without involving the enzyme. This reaction are related to the development of secondary complications of diabetes mellitus, Alzheimer's disease and normal aging. The initial step of the reaction of nonenzymatic glycation of hemoglobin is the Schiff base formation, producing an Amadori rearrangement, to finally give a ketoamide (glycated hemoglobin HbA1C). Glucose is the most abundant in the body reducing sugar. This implies that this sugar is generally considered in the non-enzymatic glycation reactions of biological interest. No clutch, any sugar possessing a free carbonyl group can react with the primary amino groups of proteins to form a Schiffbase. The reactivity of the different sugars is given by the availability of its carbonyl group. Sugar molecules get stabilized by a balance between the open form and at least two closed forms (cyclic anomers) in which the carbonyl group has disappeared. In the study of the acid hydrolysis to the commercial sweetener sucralose and sucralose pure performed by varying the concentration of hydrochloric acid at 2-8 N at 37 C°, no variation was found in the observed optical, which confirms that these sweeteners no hydrolysis under these reaction conditions. Reaction mixtures were prepared with various sugars or sweetener using the fol1owing concentrations; 40 mM for sucrose, sucralose and fructose and 9,3xlO-2 mM hemoglobin were prepared. Phosphate buffer concentrations were varied between 1-8 mM remaining this reaction mixture for three days for fructose and 28 days for all other sugars at 37 °C and pH 7,30. The glycated hemoglobin (HbA1C) formed was separated by ion exchange chromatography (Teco Diagnostic) and quantified spectrophotometrical1y at 415 nm. It was found that fructose is catalyzed by the phosphate buffer. The catalytic constant (kB) for fructose is seven times faster than glucose and spontaneous reaction (ko) for fructose is nine times larger than that of glucose under same reaction conditions other sugars rate constants did not exceed that reported for glucose, result suggesting of slow hydrolysis reaction. Also not isotopic solvent effect for any of the sugars found in study. Reaction with Stevia rebaudiana lyophilized at concentrations between (5, 10, 20) mg/mL, 40 mM glucose, 4.8 mM phosphate buffer and 9,3x10-2 mM hemoglobin under the same conditions reaction above, showed an inhibitory effect on the non-enzymatic glycation of the hemoglobin in vitro and in addition may be of therapeutic value in the treatment of diabetes, because the rate constants for the reaction decreases in the presence of the species plant, and with the increase in concentration thereof. Noting also that the values obtained for the total glucose concentration decrease with increasing concentration of Stevia rebaudiana, which is indicative of the hypoglycemic activity with the plant.