Caracterización molecular y bioquímica de la P57 y P75 y su interacción con la Enolasa de Trypanosoma cruzi

Abstract

La enolasa es una enzima que participa en la interconversión del D -2- fosfoglicerato (2PGA) y del fosfoenolpiruvato (PEP) durante la glicólisis y gluconeogénesis en presencia del ión magnesio. La mayoría de los tripanosomátides expresan una enolasa soluble y otra unida a membrana. Además de participar en reacciones catalíticas dentro de los parásitos, la enolasa también lleva a cabo funciones no catalíticas: receptor para diversos ligandos hasta su asociación con proteínas y ácidos nucleícos en grandes complejos supramoleculares de funciones aún desconocidas. Las interacciones proteína-proteína son eventos críticos para muchos procesos celulares que se extienden desde la formación de estructuras macromoleculares y complejos enzimáticos, hasta la regulación y la transducción de señales. La enolasa soluble de Trypanosoma cruzi interactúa y coeluye con aproximadamente 5 proteínas con pesos moleculares que oscilan desde los 45 a 80 kDa, que modulan su actividad catalítica. En base a estos antecedentes, en este estudio se amplificó, clonó y expreso de forma recombinante los polipéptidos p57 y p75 que forman parte del complejo que se asocia y copurifica con la enolasa citosólica. Las secuencias obtenidas fueron sometidas a tratamiento bioinformático encontrándose que corresponden a proteasas: una metalocarboxipeptidasa (p57) de la familia M32 y dipeptidil-peptidasa (p75) con ausencia de un e-terminal típico para este tipo de enzimas. Evidencias obtenidas a partir de la evaluación de fracciones obtenidas de la separación de las proteínas presentes en el citosol de T cruzi a través de una columna de exclusión molecular, se logro evidenciar la interacción de las proteínas p57, p75, p45 Y enolasa, al eluir en forma de complejo multiproteico, además se logró inmunoprecipitar las proteínas antes mencionadas empleando policlonales obtenidos contra las mismas, indicativo de la interacción entre ellas en el citosol celular. Todas estas evidencias plantean que la Enolasa se encuentra formando un complejo proteíco en el citosol celular, cuyo propósito permanece por ser elucidado.

Enolase is an enzyme involved in the interconversion of D -2 - phosphoglycerate (2PGA) and phosphoenolpyruvate (PEP) during glycolysis and gluconeogenesis in the presence of magnesium ion. Most of the Trypanosomatids express a soluble enolase and other membrane bound. Besides participating in catalytic reactions within the parasite enolase also conducts non-catalytic functions: receptor for various ligands to its association with proteins and nucleic acids in large supramolecular complexes of yet unknown functions. Protein-protein interactions are critical events for many cell processes extending from the formation of macromolecular structures and enzyme complexes, to the regulation and signal transduction. Enolase soluble of Trypanosoma cruzi interacts and coelutes with approximately 5 proteins with molecular weights ranging from 45 to 80 kDa, which modulate the catalytic activity. Based on this background, this study was amplified, cloned and recombinantly express the p57 and p75 polypeptides that are part ofthe complex that is associated and copurifies with cytosolic enolase. The obtained sequences were subjected to bioinformatics treatment discovering that correspond to proteases: A metallocarboxypeptidase (p57) family M32 and dipeptidyl peptidase (p75) in the absence of a e-terminal typical for this type of enzymes. Evidence obtained from the evaluation of fractions obtained from the separation of the proteins present in the cytosol of T cruzi through a gel filtration column, was achieved to demonstrate the interaction of the proteins p57, p75, p45, and enolase, to e1ute as a multiprotein complex, and immunoprecipitated proteins was achieved using aforementioned polyclonal raised against the same, indicative of the interaction between them in the cell cytosol. AH these evidences suggest that the Enolase is forming a protean complex in the cell cytosol, whose purpose remains to be elucidated.