Estudio de la interacción de los promastigotes y vesículas de membrana secretadas de leishmania spp. con el plasminógeno, componente del sistema fibrinolítico

Abstract

La interacción de una gran variedad de organismos patógenos, tanto procariotas como eucariotas con los componentes del sistema fibrinolítico, podría ser considerado un posible evento universal implicado en el proceso de invasión, diseminación y establecimiento de los patógenos en el hospedador. Esta interacción puede ser mediada a través de receptores localizados en la superficie celular, vesículas secretadas y/o proteínas con capacidad de unión al plasminógeno que le permitan al patógeno secuestrar componentes del sistema fibrinolítico del hospedador, promoviendo así la degradación de la fibrina y proteínas de la matriz extracelular. Asimismo, entre los organismos eucariotas, se ha demostrado que Leishmania mexicana, agente causal de la Leishmaniasis cutánea, tiene la capacidad de interaccionar con los componentes del sistema fibrinolítico: plasminógeno y plasmina. En ese sentido, se realizó un estudio de la interacción de los promastigotes y vesículas de membrana secretadas por Leishmania spp. con el plasminógeno. Las vesículas de membrana de Leishmania spp. fueron purificadas por ultracentrifugación luego de someter los parásitos a un proceso de secreción en medio mínimo durante 24 horas. La caracterización bioquímica de las vesículas de membrana de L. mexicana se llevó a cabo mediante electroforesis, Western blotting y Ligand blotting utilizando plasminógeno como ligando. Se detectaron diferentes proteínas: factor de elongación la, fosfoglicerato quinasa, gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa, GP63, y dos proteínas receptoras de plasminógeno: Enolasa y LACK. Adicionalmente se logró identificar por espectrometría de masas un nuevo receptor de plasminógeno, el cual fue posteriormente clonado y sobreexpresado en Escherichia coli. Este receptor es la proteína miristoilada pequeña 1 (SMP-l). SMP-l recombinante fue capaz de unir plasminógeno de manera dosis dependiente y saturable, con una constante de disociación (Kd) de 0,24 uM, valor que se encuentra dentro del rango fisiológico de la concentración de plasminógeno sanguíneo. Esa interacción fue inhibida por el ácido F-aminocaproico, sugiriendo que en la unión están involucrados residuos de lisina; asimismo, los ensayos realizados con carboxipeptidasa B, confirmaron una inhibición en un 65% de la interacción, indicando que la lisina encontrada en el extremo carboxiloterminal está implicada en el reconocimiento con el plasminógeno. Empleando los anticuerpos polic1onales anti SMP-l, se demostró la presencia de SMP-l en el flagelo y en las vesículas de membrana de las tres especies de Leishmania. Se demostró a su vez que L. braziliensis y L. infantum, al igual que L. mexicana, también tienen la capacidad de unir plasminógeno humano, siendo mayor en los promastigotes en fase estacionaria y los sometidos a choque térmico, observándose gran analogía en la inhibición de la interacción parásitos-plasminógeno por el ácido e:-aminocaproico, sugiriendo que en la unión están involucrados residuos de lisina. Los valores de constantes de disociación (Kd) para la unión con plasminógeno son similares, denotando que no existen diferencias considerables en la capacidad de unión al plasminógeno entre las tres especies de Leishmania evaluadas. Estos hallazgos nos permiten proponer como modelo que los promastigotes de Leishmania spp. en fase estacionaria expresan receptores de plasminógeno en su superficie y además secretan vesículas de membrana que contienen estos mismos receptores: Enolasa, LACK y SMP-I, que podrían constituir nuevos factores de virulencia en Leishmania.

The interaction of a wide variety of pathogenic organisms, both prokaryotic and eukaryotic with fibrinolytic system components, could be considered a possible universal event involved in the invasion process, dissemination and establishment of pathogens in the hos1. This interaction may be mediated through receptors located on cellular surface, secreted vesicles and/or proteins with plasminogen binding capacity that would allow the components sequester pathogens host fibrinolytic system, this promoting the degradation of fibrin net and extracellular matrix proteins. Also among eukaryotic organisms, it have been shown that Leishmania mexicana, causal agent of cutaneous Leishmaniasis, has the ability to interact with the fibrinolytic system components: plasminogen and plasmin. In this sense, a study of the interaction of promastigotes and secreted membrane vesicles of Leishmania spp. with the plasminogen was carried out. Membrane vesicles of Leishmania spp.were purified by ultracentrifugation after submitting the parasites to a process of secretion in a minimum medium for 24 hours. The biochemical characterization of the membrane vesicles of L. mexicana was carried out by electrophoresis, Western blotting and Ligand blotting using plasminogen as a ligando Different proteins were detected: elongation factor-la, phosphoglycerate kinase, glyceraldehydes 3 phosphate deshydrogenase, GP63, and two receptors proteins plasminogen: Enolase and LACK. Additionally, we identified by mass spectrometry a new plasminogen receptor, which was subsequently cloned and overexpressed in Escherichia coli. This receptor is a small myristoylated protein SMP-I. SMP-l recombinant was able to bind plasminogen in adose dependent and saturable manner with a dissociation constant (Kd) of 0,24 uM, value that is within the physiological range of the plasminogen blood concentration. This interaction was inhibited by e-aminocaproic acid, suggesting that in the binding are implicated lysine residues. Further, assays performed with carboxypeptidase B treatment, confinned an inbibition of 65%, indicating that lysine residue found at the carboxyItenninal end is involved in the recognition of plasminogen. Using polyclonal antibodies anti SMP-l, it was showed the presence of SMP-l in the flagelhun and in the membrane vesicles of the three Leishmania species. Also we demonstrated that L. braziliensis and L. injemtum, like L. mexicana, have the ability to bind human plasminogen, this binding being higher in stationary phase promastigotes and those submitted to heat shock. In all case the binding was inhibited by r-aminocaproic acid, suggesting that lysine residues are involved. Values of dissociation constant (Kd) for the binding to plasminogen are similar, denoting dIere are not considerable differences in plasminogen binding capacity between the three Leishmania species tested. These findings allow us to propose as model that promastigotes of Leishmania spp. in the stationary phase, express plasminogen receptors on their surface and also secreted membrane vesicles contailling the same receptors: Enolase, LACK al1d SMP-l, which could be new virulence factors in Leishmania.