Enzimas de la glicólisis y de la biosíntesis de los esteroles de Trypanosoma cruzi : una alternativa como blancos para el tratamiento de la enfermedad de Chagas

Abstract

En la presente investigación se estudiaron varias enzimas importantes de la glicólisis (fosfoglicerato kinasa, hexokinasa, piruvato fosfato dikinasa y α-glicerol fosfato deshidrogenasa) y de la biosíntesis de esteroles (3-hdroxi-3-metil glutaril CoA reductasa, escualeno sintetasa, 24(25)-SMT) en varias formas de Trypanosoma cruzi y algunas en promastigotes de Leishmania mexicana, como posibles blancos para el tratamiento de la Enfermedad de Chagas y la Leishmaniasis. Todas las enzimas glicolíticas estudiadas y las de biosíntesis de esteroles fueron ubicadas en los glicosomas, aunque las enzimas de los esteroles tuvieron también una localización en microsomas/mitocondria. La ubicación de estas enzimas fue confirmada a través de tres metodologías diferentes (centrifugación isopícnica, diferencial y permeabilización selectiva con digitonina). Además, la secuencia de la hexokinasa presentó una señal de importación PTS2, en contraste con las secuencias de la tosto glicerato kinasa (PGKA y C) que no presentaron ninguna señal de importación hacia los glicosomas. La caracterización bioquímica y molecular para las enzimas de la glicólisis mostró una serie de particularidades importantes en cuanto a propiedades y constantes cinéticas (Km, Vm y Ki), con respecto a su contraparte en vertebrados. La hexokinasa se comportó como una verdadera glucokinasa con un cinética que presentó periodo de retardo, típico de enzimas histereticas y fue inhibida por PPi. En Trypanosoma cruzi se determinaron tres isoenzimas PGKs, la PGKA y C localizadas en el glicosoma y la PGKB en el citosol. A diferencia de otras PGKs en otros organismos, la PGKA de T. cruzi presentó una extensión N-terminal adicional de 80 aminoácidos. Adicionalmente, esta enzima está interactuando fuertemente con la membrana del glicosoma, a pesar de que no posee una secuencia de aminoácidos hidrofóbica como para ser una proteína de membrana, este resultado fue confirmado con Tritón X-114 y carbonato de sodio. La piruvato fosfato dikinasa fue localizada principalmente en los glicosomas y fue activada por acetil-CoA. mientras que el acetil-CoA inhibió a la PEPCK. Esta enzima debe jugar un papel muy importante en los glicosmas detoxificando a la organela del PPi producto de las rutas de biosíntesis que ocurren en el glicosoma y además generando ATP y piruvato. La PPDK estaría haciendo el rol de la pirofosfatasa, de igual forma a como se ha reportado para los peroxisomas. La α-glicerol fosfato deshidrogenasa fue localizada exclusivamente en los glicosomas de T. cruzi y esta es la primera vez que se ha reportado en estos parásitos. Esta enzima es activa solamente en un cierto estado del crecimiento de los epimastigotes, aun cuando ella esta presente sin actividad detectable a lo largo de toda la curva de crecimiento. La α-glicerol fosfato deshidrogenasa es posible que juegue un papel fundamental en mantener el balance redox en los glicosomas. La HMG-CoA reductasa, cataliza el primer paso comprometido del mevalonato y es una enzima soluble de la matriz de los glicosoma de T. cruzi y Leishmania mexicana, contrastando con las HMG-CoA reductasas integrales de membrana (retículo endoplásmico) de otros organismos. Esta enzima asociada a los glicosomas de ambos parásitos, presentaron una cinética clásica del tipo Michaelis-Menten y una fuerte inhibición por lovastatina, un inhibidor clásico de esta enzima. Este es el primer reporte de la presencia de una enzima de la biosíntesis de isoprenoides en los glicosomas. La escualeno sintetasa (SQS) cataliza el primer paso comprometido en la biosíntesis de esteroles y es una enzima unida a membranas en epimastigotes de T. cruzi y promastigotes de Leishmania mexicana con una localización subcelular dual, entre glicosomas y vesículas de microsomas/mitocondria. Los estudios cinéticos de la enzima de los parásitos mostraron que los valores de las constantes cinéticas fueron muy similares a la SQS de los mamíferos. El BPQ-OH un potente inhibidor para la enzima de mamíferos, también lo fue para la SQS de T. cruzi y Leishmania mexicana. La inhibición del crecimiento y lisis celular inducida por el BPO-OH en ambos parásitos estuvo asociado con una privación completa del escualeno y esteroles endógenos, consistente con un bloqueo en la síntesis de novo de esteroles a nivel de la SQS. Nosotros también investigamos las bases moleculares de la actividad del 4-fenoxifenoxietil tiocianato (WC-9) contra T. cruzi. Encontramos que la inhibición del crecimiento de los epimastigotes de T. Cruzi inducida por este compuesto fue asociada con una reducción en el contenido de los esteroles endógenos del parásito, debido a un bloqueo específico en la síntesis de novo de los esteroles a nivel de la SQS. Los compuestos E5700 y ER-119884 están basados en quinuclidinas. Estos compuestos fueron potentes inhibidores no competitivos o de tipo-mixtos para la SQS de T. cruzi con valores de Ki en el orden de subnanomolar en presencia de PPi. El compuesto E5700 a la concentración de IC50 presentó un potente efecto antiproliferativo sobre las formas epimastigotes y amastigotes, respectivamente, sin ningún. efecto sobre las células hospedadoras. A la MIC todos los esteroles desaparecen de los parásitos en células tratadas con este compuesto. Los estudios in vivo indican que E5700 fue capaz de suministrar una protección total contra la muerte e inhibió completamente el desarrollo de la parasitemia cuando es suministrado a 50mg/Kg.d por 30 días. Este es el primer reporte de un inhibidor de la SQS activo por vía oral, capaz de proporcionar una protección completa contra la fase aguda fulminante de la enfermedad de Chagas. La enzima 24(25) esterol Metil transferasa (SMT) fue localizada como una enzima asociada a membranas en los glicosomas y en las fracciones microsomales de epimastigotes de T. cruzi y promastigotes de Leishmania mexicana. Los valores de las constantes cinéticas fueron muy similares a los reportados para la SMT de hongos y levaduras. La enzima SMT de estos parásitos tienen una mayor afinidad por el demosterol que por el lanosterol como sustrato y el azasterol un análogo de esteroles, inhibió a la SMT (glicosomal y microsomal) de forma competitiva con respecto al demosterol y no competitiva para el AdoMet. El glicosoma de T. cruzi y Leishmania mexicana encierra enzimas de oxidación de la glucosa y de la biosíntesis de esteroles, con propiedades fisicoquímicas distintas a las de sus contrapartes en los mamíferos. Estas diferencias podrían ser utilizadas como potenciales blancos para el desarrollo de nuevos inhibidores específicos para erradicar infecciones provocadas por estos parásitos en los humanos.