Expresión y purificación de la hexoquinasa utilizando el sistema homólogo pTcINDEX en epimastigotes recombinantes de Trypanosoma cruzi cepa Ep

Abstract

T. cruzi posee un metabolismo energético que depende principalmente de glucosa como fuente de carbono y energía. Gran parte de la vía glicolítica en T. cruzi está compartimentalizada en el interior de los glicosomas, y la primera reacción de la ruta corresponde a la transferencia de un grupo fosforilo a la glucosa, catalizada por la HK. Empleando el sistema homólogo pTcINDEX en T. cruzi, el objetivo fundamental de este trabajo fue la caracterización fenotípica de los parásitos mutantes que sobre-expresan la enzima HK-(His)6, la optimización de la expresión y la caracterización de la misma en términos bioquímicos. Los resultados indican que la HK-(His)6 puede ser sobre-expresada 8 veces más respecto a la enzima natural, sin efectos cuantificables sobre el crecimiento, consumo de glucosa, producción de amonio o expresión de las enzimas GlcK y G6PDH. La enzima fue purificada a homogeneidad en un solo paso cromatográfico por IMAC a partir de una fracción enriquecida de glicosomas de los epimastigotes recombinantes inducidos con 5μg/ml de tetraciclina. La HK-(His)6 resultó ser más afín al anómero α de la D-glucosa (KM de 33μM y Vmáx de 0.807U/mg) y fue capaz de fosforilar D-glucosamina (KM de 863μM y Vmáx de 1.27 U/mg), pero fue incapaz de fosforilar N- Acetilglucosamina.